编者按：CAR-T疗法在血液肿瘤领域的突破性成就令人瞩目，但面对靶点局限、细胞来源单一及疗效持久性等挑战，其未来之路仍需不断探索。中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）王建祥教授团队，作为免疫治疗领域的先锋，正以基础与临床并进的姿态，深入探索血液肿瘤免疫治疗的新边界。本期《肿瘤瞭望-血液时讯》特邀王建祥教授，分享其团队在免疫治疗领域的研究成果与前瞻思考，旨在启迪临床新思，携手开创血液肿瘤免疫治疗的新篇章，为患者带来更多希望与可能。
在血液肿瘤的免疫治疗道路上，包括抗体、细胞免疫治疗，我国学者进行了大量的探索性研究，致使我国CAR-T细胞治疗研究处于世界领先水平。我们院所课题组自主研发的CD19 CAR-T治疗药物也已获批上市，历经从研发到成果转化，再到产品化的完整过程。此外，我们对其他已知的靶点也进行了布局，包括针对髓系肿瘤的CD33、CD123靶点；针对B淋系肿瘤的CD20、CD22靶点；针对T淋系肿瘤的CD5、CD7靶点；以及针对浆细胞肿瘤的BCMA、CD38靶点等。
然而，尽管我国学者在血液肿瘤的免疫治疗上做了大量出色的工作，但在该领域仍存在许多尚未解决的问题，例如靶点种类不足、细胞来源集中、疗效持续较短、毒性反应较大等。下面结合我们团队的研究，分享在探索免疫治疗新靶点及疗法和拓展优化效应细胞方面的见解和心得。
免疫治疗新靶点及疗法探索
根据白血病发生的多打击学说，白血病的打击分为一次打击、二次打击，通过打击不同造血细胞，可分别发生急性髓系白血病（AML）、急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）、急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）。除对造血细胞的打击外，肿瘤微环境也是影响白血病发生发展的重要因素，包括对造血细胞的支持、对免疫微环境的抑制以及免疫微环境对白血病细胞是否有直接刺激作用。针对这些问题，我们开展了一项研究，探讨了免疫逃逸及其对白血病发生的直接影响。
△研究论文截图
01
Treg细胞对小鼠生存的影响，完全是由免疫逃逸引起的吗？
在白血病的微环境当中，我们明确发现调节性T细胞（Treg细胞）明显增多。我们知道，Treg细胞增多，抑制活性增强，会使Th1、Th2的极化出现异常，更容易发生免疫抑制和逃逸。因此，Treg细胞与小鼠的疾病生存、进展有关。那么，Treg细胞对小鼠生存的影响，完全是由免疫逃逸引起的吗？我们的研究发现，Treg细胞可使小鼠白血病细胞的干性增强，包括侧群细胞（SP）比例增加、G0期细胞比例增加、原始集落形成能力增强。之后我们在原代细胞中也验证了该结论。
02
Treg细胞间的接触是通过什么介质来发挥作用的？
通过对Treg细胞进行细胞因子分泌测定，我们发现白细胞介素10（IL-10）的分泌大量增加。为了验证IL-10与白血病复发程度及生存之间的关系，我们进一步进行了生物细胞的功能实验，包括细胞系和原代细胞。结果发现IL-10可以直接孵育白血病细胞，并使白血病细胞的干性增加，包括侧群细胞、G0期细胞增加以及白血病细胞集落的增加。
由此可以推测，Treg细胞通过IL-10来发挥作用。那么如何来证明这个假设？我们有两种方式：一种是通过抗体阻断的方式，发现在加入IL-10受体的抗体后，侧群细胞、G0期细胞的数量以及白血病细胞集落的形成均较之前减少，证实针对IL-10受体的抗体可有效阻断这种路径；另一种是将内源性白血病细胞的IL-10受体进行敲除，发现随着IL-10受体的敲除，IL-10刺激白血病细胞干性的作用也相应消除，证实Treg细胞通过IL-10结合其受体，来发挥刺激白血病干性的作用。
△Tregs分泌IL-10并与白血病干细胞（LSCs）及生存期相关
在明确这个机制后，我们深入探索了IL-10的信号途径，希望可以在这个路径上找到可治疗的靶点。但经过一系列磷酸化研究后发现，这个路径并不特殊，主要还是通过PI3K/AKT信号通路来实现。PI3K/AKT通路大家非常熟悉，它是一个抗细胞凋亡的途径，大家对此也做了非常多的抑制剂研究，致使PI3K已成为一个很好的治疗靶点。PI3K有α、β、γ三种亚基，但在血液肿瘤的治疗中并非全部有效，需要找到针对特定肿瘤的特异性PI3K抑制剂。总之，IL-10通过PI3K/AKT磷酸化促进了白血病细胞的干性。
03
在白血病细胞的干性问题上，还有没有可深挖的机制？
我们的研究显示，Treg细胞通过PI3K/AKT信号通路，使OCT4和Nanog表达高度增加。换言之，在细胞重编程的过程中，即干细胞“返老还童”的过程中，OCT4和NANOG两个转录因子起到了非常重要的作用。同时，通过加入针对PI3K/AKT途径的抑制剂进行验证，在白血病细胞系和原代细胞中均证实，下调PI3K/AKT信号通路可实现干性逆转。
总之，通过这项研究，我们证明了 Treg细胞通过免疫抑制，增强了白血病细胞的增殖，并通过白血病细胞上的IL-10受体，使白血病细胞发挥了干性作用。为此，我们将IL-10受体作为治疗靶点，设计了新靶点的CAR-T。
04
IL-10 CAR-T的构建
由于我们实验室目前没有IL-10受体的抗体，因此采用配体替代单链抗体，构建了IL-10 CAR-T，并在体外筛选出表达IL-10受体的靶细胞。在白血病细胞的孵育中可以看到，IL-10受体阳性靶细胞可以特异性激活IL-10 CAR-T，在体外杀灭白血病细胞，在原代细胞中也有很好的杀伤作用。体内实验同样显示，IL-10 CAR-T可延长AML发病小鼠的生存期。
△以配体为CAR识别结构域设计靶向IL-10受体CAR-T
05
白血病膜蛋白组学探索新靶点
目前单纯依靠差异基因表达分析，很难再挖掘出针对白血病细胞的新靶点。另一个很重要的问题是，基因表达谱和蛋白表达谱之间存在较大差异。在基因表达谱上差异很大的，可能在蛋白表达层面没有区别；而在蛋白表达层面有区别的，在基因表达层面也可能无差异。因此，需要转化为靶点的终极表达，即聚焦于白血病细胞膜蛋白的表达，来探索新靶点。然而，这也并非易事，原因是很难分离出足够量、非常纯的膜蛋白进行质谱分析。不过，目前我们已经通过技术研究，基本克服了这两个问题。
同样，选择细胞分析的对照标准也十分重要。我们需要制备正常造血干细胞的膜蛋白，然而表达CD34的正常造血细胞（即正常造血干细胞）非常少。我们在单采室一点点收集了100多份正常造血干细胞，从中分离出了正常的CD34膜蛋白。事实上在目前我们已知的数据库中还没有正常人CD34的标准膜蛋白库，原因是一方面很难有这样的资源，另一方面也很难完成纯离的膜蛋白，但现在我们分离出来了，这样对于细胞分析就有一个很好的对照。
△白血病膜蛋白组学发现潜在靶点
通过细胞分析，我们希望找到在正常造血细胞，包括正常CD34细胞、祖细胞上表达水平低，而在白血病细胞上表达高的膜蛋白，即所谓相对特异性表达的膜蛋白。这种膜蛋白也就是好的靶点。同时，我们还需要制备抗体，有两种途径：一种是通过噬菌体展示的方式制备人源化抗体，另一种是采用传统的杂交瘤技术制备抗体，现在我们也筛出了5株抗体，进而很快制备出了CAR-T。这种针对潜在靶点的CAR-T，无论在体外还是体内均表现出很明显的杀伤作用。
目前针对这个新靶点的CAR-T，我们正在转染病毒，准备申请临床试验。同时，针对该全新靶点的CAR-T，我们还通过已报道的CD70靶点进行了验证。通过对照膜蛋白数据库可以看到，CD70在白血病细胞上呈高表达。为此，我们也制备了靶向CD70的CAR-T，目前病毒已制备完善，准备开展临床试验。说明通过膜蛋白的方式探索新靶点的途径是可行的。除了CD70 CAR-T，我们还制备了自体通用性的CAR-T，并制备了人源化抗体。制备人源化抗体的方式有：（1）通过噬菌体展示的方式制备全人源化抗体；（2）通过小鼠抗体制备人源化抗体，也能确保在体内降低免疫炎性，达到理想的作用。
细胞来源的拓展
针对细胞来源的拓展，主要聚焦于NK细胞及其关键性科学问题的解决，包括NK细胞的扩增和转染。在扩增方面中，滋养层细胞是一种通用的、高效的扩增方式，可有效活化原代NK细胞。在转染方面，我们针对自体成熟NK细胞转染难、表达难的问题进行了优化，并对NK细胞的启动子元件进行筛选，发现CMV启动子启动的基因表达可实现NK细胞靶基因高效转导与稳定表达，RectroNectin与Polybrene联用可有效提高NK细胞慢病毒转导效率。
△原代NK细胞慢病毒感染及表达体系优化
此外，NK细胞具有天然的杀伤病毒作用，为进一步提高转染效率，我们在抑制其细胞途径方面也进行了探索。结果发现，加入相关抑制剂后可部分增加转染效率，但无法得到根本性改善。同时，在提高NK细胞活性方面，我们以NK-92细胞系为模式细胞开展了高通量CRISPR基因筛选，发现了一些潜在靶点，下一步将通过数据一一验证，找到可以提高NK细胞活性的确切靶点。
综上，除了在临床研究中探讨已有的细胞治疗外，我们在白血病的发病机制、新靶点及疗法的研发、效应细胞的优化与拓展等方面也进行了一些探索，以期提高细胞治疗的疗效、安全性和可及性。事实上，在整个转化医学过程中，临床医生扮演着不可或缺的重要角色，可参与多个环节，包括提出重大科学问题、通过实验发现新的机制和技术、在企业将技术转化为产品后再进行临床试验以及将被研究证实的药物应用于临床，最终为社会带来贡献。
参考文献：
1. Xu Y,et al,Leukemia,2022,36:403-415.
2. Nat.Rev.Clin.Onco.2020,17:147-167.
专家简介
王建祥 教授
中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）临床首席专家；
国家血液系统疾病临床医学研究中心主任；
教授，主任医师，博士生导师；
中国医学科学院北京协和医学院首批长聘教授；
国家百千万人才工程国家级人选；
中华医学会血液学分会第十届主任委员；
中国医师协会内科医师分会副会长、血液科医师分会副会长等职务；
天津授衔专家、海河医学学者、首届天津名医、获天津市“十佳”医务工作者、“中国好医生”月度人物；
从事血液病临床与基础工作多年，对各种血液病的诊治具有丰富的临床经验，现主要从事白血病及血液肿瘤的临床与基础研究。