编者按：春意盎然，万物复苏。2024年3月23～24日，由中华医学会主办的第十五次实验诊断血液学学术会议暨第一次血液罕见病学术会议在姑苏城盛大召开。会议特邀国内外血液学领域的知名专家和学者进行精彩学术报告和专题讨论，旨在推动实验诊断血液学及血液罕见病领域的学术交流与合作，分享最新的研究成果，探讨行业发展趋势，共同促进我国血液学科的繁荣发展。会上，江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）吴雨洁教授分享了题为“CLL-MRD的流式规范化检测”的精彩内容，本刊特别整理如下，以飨读者。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是一种成熟B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴器官聚集的惰性淋巴肿瘤，发病率逐年上升。CLL主要见于老年人患者，发病高峰是60～80岁。布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）、磷脂酰肌醇3激酶抑制剂（PI3Ki）及B细胞淋巴瘤2（BCL2）抑制剂（BCL2i）等新型靶向药物使CLL的治疗进入无化疗时代，显著改善了患者的预后。然而，微小残留病（MRD）仍是导致疾病复发的根源，其不仅与无进展生存（PFS）及总生存（OS）密切相关，也能准确反映治疗后的疾病负荷、有效地评估缓解深度，因此已成为治疗终点的重要判定标准。
 

为推动CLL患者MRD检测和应用，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会和中国慢性淋巴细胞白血病工作组组织相关专家制定了《慢性淋巴细胞白血病微小残留病检测与临床解读中国专家共识（2023年版）》（简称中国专家共识）。该共识经欧洲CLL研究倡议组织（ERIC）两轮讨论，由吴雨洁教授等执笔，对推进CLL-MRD检测方法的标准化，提高MRD检测结果在临床应用实践中的高质量和可重复性具有重要参考意义。
 

01

CLL-MRD定义

CLL患者治疗后即使达到完全缓解（CR）也不意味治愈，采用更先进的诊断技术检测出体内极低水平的CLL细胞，称为CLL-MRD。MRD阴性可能存在两种情况：一种是患者体内确实已经不存在CLL细胞；另一种是现有技术的局限导致无法检测到患者体内的微量CLL细胞。
 

根据ERIC和国际慢性淋巴细胞白血病工作组（iwCLL）标准，将10-4作为临床判断CLL-MRD阴、阳性的阈值。残留的CLL细胞比例＜10-4，被定义为u-MRD（undetectable MRD），以可检测（detectable，d）或不可检测（undectable，u）进行阈值区分，可采用MRD4、MRD5表明上限，如MRD4代表残留病灶＜0.01％或10-4。
 

02

CLL-MRD样本要求
 

目前用于CLL-MRD的检测方法有流式细胞术（FCM）、二代测序（NGS）等。检测样本为外周血（PB）或骨髓（BM）。PB的MRD检出率往往低于BM，推荐先做PB，如MRD检测阴性再做BM；而对于旨在实现深度缓解的治疗，推荐同时检测PB和BM。FCM检测样本推荐以肝素或乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝，72 h内完成；NGS推荐EDTA抗凝，新鲜样本优先，冻存样本也可使用。BM样本推荐涂片后的第1管。
 

03

FCM检测CLL-MRD——适用于所有患者

3.1 CLL典型免疫表型特征
 

判断某个抗原的表达强度应以对应阶段的正常B细胞作为内参照，如平均荧光强度（MFI）高于正常B细胞判断为强表达，反之则为弱表达。CD43、CD81和CD20在成熟小B细胞淋巴瘤中的表达模式见下图。
 

ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体)是一种具有高度识别性的肿瘤特异性标志物，参与调解肿瘤干细胞Wnt5a信号通路，在CLL中呈高表达。Leukemia Research上发表的一项研究显示，平均96.8% CLL细胞ROR1阳性（范围为80.1～99.8%）。吴雨洁教授作为通讯作者的一项研究显示，ROR1可以作为CLL的辅助诊断标记物，尤其对不典型免疫表型CLL、MCL及其他类型B-CLPD的诊断及鉴别诊断有重要价值。ROR1在正常BM中B细胞表达特点见下图。

3.2 FCM检测CLL-MRD依据和方案

FCM检测CLL-MRD的依据是通过细胞表面一系列抗原的特征性表达识别CLL细胞。典型的CLL免疫表型为：CD19＋、CD5＋、CD23＋、CD10-、FMC7-、CD81-、CD43+、ROR1＋、CD200＋＋、CD45＋、CD20、CD22和/或CD79b减弱、kappa or lambda单克隆弱表达。
 

2016年ERIC在Leukemia论文中推出了八色单管标准化方案，核心抗体为CD81、CD20、CD22、CD43、CD5、CD79b、CD19、CD3，其中没有轻链。针对中国流式标准化存在的问题，吴雨洁教授进行了相关研究。通过试验对有或无轻链的检测方案进行对比，检测257例次，仅有31例次（12%）存在不一致现象。对不一致的结果进行分析发现无轻链组合具有更高的敏感性。分析原因可能是CLL中有1/4的kappa/lambda阴性无法检测，且检测处理步骤和样本本身等因素对于轻链影响大。研究结果提示轻链检测为非必要检测。
 

此外，ERIC专家组进一步提出：（1）CD3并非在所有情况下都需要，如果是在0.0010～0.010%范围要求非常高的准确度，则可能是多余的信息；（2）在CD5、CD79b、CD43和CD81出现⩾2种典型CLL表型时CD20和CD22也不是必须要检测；（3）包括六种标记物（CD19、CD20、CD5、CD43、CD79b、CD81）的核心抗体组合被定义为鉴定CLL核心抗体组合。

中国专家共识推荐CLL-MRD八色及以上单管方案，应尽可能简化又能够充分区分正常成熟B细胞和CLL细胞，筛选出CLL细胞高频异常表达且在治疗前后表达较稳定的八种核心抗原，包括：CD19、CD20、CD79b、CD5、CD81、CD43、ROR1、CD45。注意其中并没有CD22和CD3，而是增加了ROR1和CD45。通过CD45设门以白细胞数作为计算MRD的分母可以有效提高不同实验室结果判读的一致性和结果的准确性，这在多中心临床药物试验的比较中尤为重要。FCM检测CLL-MRD的流程详见下图。
 

针对中国专家共识FCM-MRD方案的重复性验证，江苏省人民医院分别在24小时和48小时在同一个实验室的同一台流式细胞仪上，由同一个检测人员对同一份样本检测，结果显示24 h MRD=1.21%，48 h：MRD=1.23%。另一项研究是由两个实验室均采用盲法对10个样本的数据进行分析和记录，结果从两个实验室获得的MRD水平无显著差异（配对T检验，P=0.018，SD=0.29），且统计相关性强（R=0.99，P<0.0001，95%CI：0.959～0.998）。此外，实验室间的变化很小（bias 0.135；95%CI：-0.439～0.709），表明包含CD45-ROR1的抗体组合检测结果具有良好的可重复性，受样品制备和分析员经验的影响较小无轻链也能区分CLL-MRD和B1细胞，见下图。
 

3.3 FCM与NGS MRD检测及注意事项
 

FCM及NGS MRD技术检出MRD水平具有高度一致性。在一项iFCR队列研究中，共有60例外周血样本及57例骨髓样本进行了配对的FCM及NGS MRD检测。结果显示，

94.2%（49/52）的外周血样本被FCM及NGS同时认定为MRD4阴性，其中NGS MRD检出40.8%（20/49）为MRD6，16.3%（8/49）为MRD5，42.9%（21/49）为MRD4。

93.2%（41/44）的骨髓样本被FCM及NGS同时认定为MRD4阴性，其中NGS MRD检出43.9%（18/41）为MRD6，12.2%（5/41）为MRD5，43.9%（18/41）为MRD4。
 

3例早期取得MRD6水平阴性患者，长期动态检测始终保持MRD6水平阴性；中期MRD>1%的患者不能从额外的化疗中获益。
 

CLL-MRD检测的注意事项:（1）对于极少数ROR1阴性同时免疫表型不典型的CLL，应增加kappa和­lambda协助判断。（2）患者接受CD20单抗治疗后会导致CD20表达减弱甚至消失。（3）CD19-CAR-T细胞治疗后，可采用ROR1联合CD24作为替代设门标记。（4）对于追求疾病缓解最大化的临床试验、CAR-T、造血干细胞移植等治疗手段时，选择10-5～10-6作为阈值可能更具临床价值。可采用二代流式细胞术（NGF），获取细胞数超过2×106时，敏感性能到10-5以上。

3.4 FCM检测的获取细胞数和报告方式

目前国际上通用的可重复识别MRD细胞群体的最低检出限（limit of detection，LOD）为20个成簇细胞，即LOD＝20/获取的白细胞总数×100％。据此，至少需要获取20万个白细胞，灵敏度才能达到10-4。而通用的识别MRD细胞群体的最低定量限（limit of quantitation，LOQ）为 50个成簇的细胞，即LOQ＝50/获取的白细胞总数×100％，因此至少需要获取50万个白细胞。FDA要求，MRD检测阈值应至少低于临床决策阈值（MRD定义）的10-1。
 

FCM检测的CLL-MRD报告方式：CLL-MRD细胞<20个，在报告上写明MRD阴性，或未检测到；如MRD阳性，应根据MRD细胞数占白细胞的百分比报告，同时描述该群细胞的免疫表型特点。例如：<20个CLL细胞，报告：未检测到MRD（LOD:0.01%）；在100万个细胞中检测到60个CLL细胞，报告：CLL-MRD=0.006%（LOQ：0.005%）；在100万个细胞中检测到30个CLL细胞，报告：检测到CLL-MRD，低于LOQ（0.002-0.005%）。
 

3.5 CLL-MRD检测时间点
 

对于接受化疗的患者，CLL-MRD检测应与治疗反应评估同时进行，包括中期疗效评估以及末次治疗结束后至少2个月。对于缓解深度有限的长期治疗模式，在获得最佳临床疗效时应进行CLL-MRD检测。对于参加临床试验的患者，按研究设计在固定时间进行CLL-MRD检测。对于实现部分缓解的患者，也应检测MRD。

参考文献：

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专家简介

吴雨洁 教授

江苏省人民医院血液内科科副主任

内科血液学博士，研究员，硕士生导师，江苏省六大人才高峰高层次人才。

担任国家药品监督管理局医疗器械评审中心专家、中华医学会血液学分会实验诊断学组委员、中国生物工程学会细胞分析专业委员会常委、中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞学组常委、中国中西医结合学会中西医检验医学专委会流式细胞分析诊断专家委员会副主任委员、中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会常委、中国抗癌协会CLL工作组委员、 从事流式细胞术的临床应用、血液病诊断和基础研究工作，执笔及参与多个专家共识的撰写。主持多项国家及省自然课题，获四项发明专利授权。